Era hijo de Tutmosis II y de una concubina llamada Isis. Accedió al trono cuando era niño y formaba parte del clero de Amón. Hatshepsut, la anterior esposa real, sería regente hasta el séptimo año de reinado conjunto. Fue entonces cuando ella se proclamó faraón y relegó a Tutmosis a segundo plano. Hatshepsut murió en el año 1468 y Tutmosis acupó el trono.

Durante su primera campaña se enfrentó al rey de Qadesh. Obtuvo la rendición temporal de Qadesh, pero, al regresar a Egipto, Qadesh volvió a sublevarse. Su reinado supuso para Egipto una época larga de 54 años sin problemas internos. Construyó en Tod, Medamud, Ermant y Karnak. Su templo funerario construido en Deir el-Bahari, entre los de Mentuhotep II y la reina Hatshepsut, está destruido.

Asoció a su hijo Amenhotep II, que le sucedió cuando el falleció, en el año 1436. Su tumba se haya en el Valle de los Reyes y su decoración es simple, pero brillante. Es muy característica porque nunca hasta entonces se había visto una decoración como esa en ninguna otra tumba de la necrópolis tebana.